蛋白质浓度的测定方法有哪些(Different Methods of Protein Concentration Determination)?

有上百种不同的蛋白质浓度测定方法。生物化学家分析的蛋白质溶液种类的多样性令人难以置信,这就是为什么没有一种通用的方法适用于每种类型的蛋白质溶液。最常见的蛋白质分析是布拉德福德法,Lowry分析法和双辛酸分析法...
有上百种不同的蛋白质浓度测定方法。生物化学家分析的蛋白质溶液种类的多样性令人难以置信,这就是为什么没有一种通用的方法适用于每种类型的蛋白质溶液。最常见的蛋白质分析是布拉德福德法,Lowry分析法和双辛酸分析法。尽管如此,为了解决蛋白质溶液和分析中使用的试剂之间的任何潜在化学不相容性,已经开发了各种各样的变体。在一种蛋白质浓度测定方法中,在蛋白质溶液中加入一种与蛋白质结合的有色染料。一般来说,蛋白质浓度测定有两大类:第一类方法是在蛋白质溶液中加入彩色或荧光染料,它与蛋白质特异结合。结合染料有一个独特的吸收波长,它与蛋白质的量成正比。通过使用分光计,可以估计蛋白质的浓度。第二组实验包括在蛋白质溶液中加入铜(II)离子,当这些离子被还原成铜(I)离子时,这些还原的离子就能够通过与蛋白质结合而形成五颜六色的复合物。通过测量它们独特波长的吸收率,蛋白质的浓度同样可以推断出来。最流行的蛋白质浓度测定方法之一是布拉德福德法。在这种方法中,在酸性条件下,将一种叫做考马斯亮蓝的红色染料加入到蛋白质溶液中。当这种染料与蛋白质结合时,它形成一种永久性的蓝色络合物,具有595纳米的特征吸光度,尽管布拉德福德分析法具有通用性,但它与某些蛋白质溶液不相容特别是,十二烷基硫酸钠(SDS)的存在会干扰Bradford分析,十二烷基硫酸钠是一种常用于纯化蛋白质和裂解细胞的洗涤剂。这种洗涤剂干扰染料与蛋白质的结合,从而导致不可靠和不准确的吸收读数。那么,其他类型的方法,必须在SDS存在的情况下使用。已经开发了另一系列的蛋白质分析,它们都涉及双缩脲试验的变化。在这个反应中,蛋白质与水基和铜(II)离子结合。这些离子被还原,然后被蛋白质螯合形成彩色络合物。使用该试验的两种分析方法是Lowry试验和Bicinchonic acid试验。在Lowry试验中,在双缩脲试验中加入Folin Ciocalteu试剂。Folin Ciocalteu试剂氧化芳香残基,特别是色氨酸,有助于络合物在750纳米处的强烈吸收。另一方面,双氰基酸的测定包括在双缩脲试验中加入双辛酸。在大约104°F(40°C)下短暂培养后,两种当量的酸和蛋白质的肽键螯合一个单一的铜(I)离子,其结果是形成一种在562纳米处强烈吸收的络合物。在选择蛋白质浓度测定方法时,重要的是要考虑溶液中存在的不同化学官能团。某些氨基酸侧链的存在,二硫键和辅因子会使蛋白质浓度的测定变得非常不准确,不仅要考虑蛋白质,还要考虑其他试剂和缓冲液,如还原剂和洗涤剂。理想的方法是化学相容的,而且可靠、廉价和易于建立。
  • 发表于 2020-09-07 00:58
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  • 分类:科学教育

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